总RNA的提取（Trizol法提取）

在收集到生物材料之后，*好能即刻进行RNA制备工作。若需暂时储存，则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80℃冷冻柜。在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。

1.      提取组织RNA时，每50～100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行裂解；提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5-10 ╳10⁶个细胞加1ml Trizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞；

2.      将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温15~30C下放置5分钟；

3.      在上述EP管中，按照每1ml TRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下（15℃～30℃）放置2～3分钟后，12000g（2℃～8℃）离心15分钟；

4.      取上层水相置于新EP管中,按照每1ml TRIZOL加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下（15℃～30℃）放置10分钟,12000g（2℃～8℃）离心10分钟；

5.      弃上清，按照每1ml TRIZOL加1ml 75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g（2℃～8℃）离心5分钟，弃上清；

6.      让沉淀的RNA在室温下自然干燥；

7.       用Rnase-free water 溶解RNA沉淀。                       

PCR

实验室常用DNA聚合酶有三种：TaKaRa Taq^TM，TaKaRa E_XTaq^TM和Pyrobest^TM DNA Polymerase。TaKaRa Taq^TM是一般的DNA聚合酶，保真性较差，但价钱便宜，一般用于基因表达的检测等。TaKaRa E_XTaq^TM是具有Proof reading活性的耐热性DNA聚合酶，具有一定的保真性，而且其扩增得到的PCR产物3’端附有一个“A”碱基，如果希望直接将产物克隆到T-vector可以用此酶。Pyrobest^TM DNA Polymerase也是具有Proof reading活性的耐热性DNA聚合酶，其特点是保真性极高，扩增得到的PCR产物为平滑末端。如果进行基因的扩增请使用此酶。

1.      按下列组成在PCR反应管中调制反应液：

TaKaRa Taq^TM或TaKaRa E_XTaq^TM的配方

Pyrobest^TM DNA Polymerase的配方

①    反应总体积根据实际情况进行调控，可以做20~50µl以节约试剂；

②    将上表各成分加入到0.2ml或0.5ml**的PCR薄壁管中；

③    如果不用PCR仪的加热盖，在反应混合液的上层加30 ~50µl 的矿物油防止样品在PCR的过程中蒸发；

2.      按以下程序进行PCR扩增。

PCR反应条件视模板、引物等的结构条件不同而各异，在实际操作中需根据具体的情况以及PCR结果而进行优化。

反应结束后，抽取扩增样品5µl，用琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果，用DNA marker判断扩增片段的大小或冷冻保存，以备以后分析使用。

RT-PCR

Protocol: TaKaRa One Step RNA PCR Kit (AMV)

1. 按下列组成在PCR反应管中调制反应液

1.      反应总体积根据实际情况进行调控，可以做20~50µl以节约试剂；

2.      将上表各成分加入到0.2ml或0.5ml**的PCR薄壁管中；

3.      如果不用PCR仪的加热盖，在反应混合液的上层加30 ~50µl 的矿物油防止样品在PCR的过程中蒸发；

2．按以下条件进行反应

反应结束后，抽取扩增样品5µl，用琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果，用DNA marker判断扩增片段的大小或冷冻保存，以备以后分析使用。

琼脂糖核酸电泳

1.        用蒸馏水将制胶模具和梳子冲洗干净，放在制胶平板上，封闭模具边缘，架好梳子；

2.        根据欲分离DNA片段大小用凝胶缓冲液配制适宜浓度的琼脂糖凝胶：准确称量琼脂糖干粉，加入到配胶用的三角烧瓶内，定量加入电泳缓冲液（一般20~30 ml）；

3.        放入到微波炉内加热熔化。冷却片刻，加入一滴荧光染料，轻轻旋转以充分混匀凝胶溶液，倒入电泳槽中，待其凝固；

4.        室温下30~45分钟后凝胶完全凝结，小心拔出梳子，将凝胶安放在电泳槽内；

5.        向电泳槽中倒入电泳缓冲液，其量以没过胶面1mm为宜，如样品孔内有气泡，应设法除去；

6.        在DNA样品中加入10×体积的载样缓冲液（loading buffer），混匀后，用枪将样品混合液缓慢加入被浸没的凝胶加样孔内；

7.        接通电源，红色为正极，黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动 (靠近加样孔的一端为负)。一般60～100V电压，电泳20～40min即可；

8.        根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳；

9.        电泳完毕，关上电源，在凝胶成像仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子量标准Marker比较被扩增产物的大小。

胶回收纯化DNA

1.      琼脂糖电泳，将特异电泳带用刀切下放入到EP管中，称琼脂糖带的重量；

2.      按照每100mg加400µl的量加入binding buffer，放入到EP管振荡器中，45℃～55℃温育振荡，直到所有的琼脂糖都溶解（大概要5分钟）；

3.      取出纯化柱，将上述溶解液转移至柱中，室温下放置2分钟，8,000rpm 离心1分钟，弃EP管中的液体，将纯化柱放回EP管中；

4.      加500µl的wash buffer至柱中，8,000rpm 离心1分钟。弃管中的溶液；

5.      重复操作4步的操作1次，*后将纯化柱放入EP管中10,000rpm离心30秒，除去痕量的wash buffer；

6.      将纯化柱放入一个新的EP管。加30~40µl H₂O或者elution buffer至纯化柱膜的中央，在37℃或50℃下放置2分钟，10,000rpm离心1分钟洗脱DNA，将EP管中的DNA溶液放在-20℃保存。

7.      注：若想要不电泳而直接纯化DNA溶液，只需要在第2步中按100µl液量加400µl的binding buffer,其余的步骤不变。

大肠杆菌质粒DNA的提取（碱裂解法）

此方法适用于小量质粒DNA的提取提取的质粒DNA可直接用于酶切PCR扩增。

1.      取1.5ml**培养物于EP管中，4000rpm离心1分钟，弃上清液，使**沉淀尽量干燥；

2.      将**沉淀重悬于用冰预冷的100 µl溶液I (50 mmol/L葡萄糖，10 mmol/L EDTA pH 8.0，25 mmol/L Tris-HCl pH 8.0) 中，剧烈振荡；

3.      加入200 µl新配制的溶液II(0.2 mol/L NaOH，1％SDS（m/v）)，盖紧EP管口，快速颠倒离心管5次，以混合混合物，确保离心管的整个内表面与溶液II接触，不要涡旋，置于冰浴中；

4.      加入150 µl预冷溶液III(每100 ml 的溶液III中含60 ml 5 mol/L 乙酸钾，11.5 ml冰乙酸，28.5 ml H₂O)，盖紧EP管口，反复颠倒数次，使溶液III在粘稠的**裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上3~5分钟；

5.      在*大转速下离心5min，取上清液于另一新EP管；

6.      用两倍体积的乙醇室温沉淀双链DNA，振荡混合于室温放置2分钟，*大转速离心5分钟；

7.      小心吸去上清液，将离心管倒置于滤纸上，以使所有液体都流出，在将附于管壁的液滴除尽；

8.      加1ml 70％乙醇洗涤沉淀，振荡混合，用12,000g离心2分钟，弃上清，将开口的EP管置于室温使乙醇挥发，直至EP管中内没有可见的液体存在（5～10分钟），用适量的ddH₂O溶解；

9.      用0.5µl的RNase 37℃温育5~10分钟；

10.  电泳鉴定。

乙醇沉淀DNA

1.        加入1/10体积的乙酸钠（3 mol∕L，PH=5.2）于DNA溶液中充分混匀，使其*终浓度为0.3 mol∕L；

2.        加入2倍体积用冰预冷的乙醇混合后再次充分混匀置于-20℃中15~30分钟；

3.        12,000 g离心10分钟，小心移出上清液，吸去管壁上所有的液滴；

4.        加入1/2离心管容量的70％乙醇，12000g离心2分钟，小心移出上清液，吸去管壁上所有的液滴；

5.        于室温下将开盖的EP管的置于实验桌上以使残留的液体挥发至干；

6.        加适量的ddH₂O溶解DNA沉淀。

酶  切

1.      酶切前确定待切样品的浓度, 并选择合适的限制性内切酶和配套Buffer。

2.      在离心管中加入如下成分：

10×Buffer  1μl

待切样品  xμl

酶        0.5-1μl 

加水补足10μl

3.      混匀样品并短暂离心使样品沉于管底。

4.      将离心管置于37℃中温育1-3hr，若待切样品为PCR产物，则可将反应时间适当延长。

5.      用未酶切的质粒作为对照，琼脂糖电泳鉴定酶切结果。

注：当酶切样品用于回收而不是鉴定时，可按比例适当加大反应体积。双酶切可选用二者活性都较高的Buffer或者通用Buffer，但要注意不能有星反应。）

连 接

1.      连接前先电泳确定待连接载体与片段的浓度。

2.      在离心管中加入如下成分：

10×连接Buffer 1μl

待连接的样品（胶回收产物或PCR产物，载体与片段的mol比为1∶3-5）

连接酶0.5-1μl 

加水补足10μl

3.      混匀样品并短暂离心使样品全部沉于管底。

4.      将离心管置于连接酶要求的温度孵育适当的时间（根据不同公司的酶的要求而定，一般为22℃ 1-3hr或16℃连接过夜）。

连接完的样品可直接用于转化，也可放4℃冰箱短期保存。

感受态细胞的制备

1.      挑取适当菌株的E.coli 单菌落接种于2ml SOB培养液中，37℃摇床过夜。

2.      取0.5-1ml过夜培养的菌液转种到50ml SOB中，18℃剧烈震荡，直到A₆₀₀达到0.6。

3.      将培养物转移到50ml离心管中，4℃ 4,000rpm/min离心10min。同时在冰浴上配置TB溶液。

4.      弃上清，将离心管倒置于滤纸上，使培养液被吸干。

5.      取1ml刚配的TB溶液打散菌体沉淀，再加入15ml TB（1/3体积的起始培养液），冰浴10-15min，4℃ 4,000rpm/min离心10min。

6.      弃上清，沉淀重悬于4ml TB（1/12.5体积的起始培养液），冰浴10min。

7.      加入280μl  DMSO，缓缓滴入并轻轻摇晃，使其充分混合均匀，冰浴10min。

8.      将菌液分装于EP管中，-80℃或液氮冻存。

9.      取两管感受态细胞分别加入1μl无菌ddH₂O（阴性对照）和1μl纯质粒（阳性对照）进行转化（见后），以检测感受态的质量。阴性对照平板上应该无菌落生长，阳性对照平板上菌落数目的多少显示感受态效率的高低。

SOB的配制：

蛋白胨        20g

酵母提取物    5g

NaCl          0.58g

KCl           0.186g

100×Mg⁺⁺溶液 10ml

溶解并加水定容至1L，121℃×20min高压蒸汽**

100×Mg⁺⁺溶液：  

MgCl₂﹒6H₂O

MgSO₄﹒7H₂O

溶解并加水定容至100ml，121℃×20min高压蒸汽**

TB溶液的配制：

   1M  KCl                       5ml

0.55M MnCl₂                    2ml

0.5M  CaCl₂                    0.6ml

0.1M K-Pipes(pH 6.7)             2ml

ddH₂O                         10.4ml

Total                         20ml

注：上述溶液均需高压蒸汽**处理

0.1M K-Pipes(pH=6.7)的配制：

     称取3.02g Pipes粉末溶于80ml dd H₂O中，此时粉末不能完全溶解，用10N KOH或KOH固体调节PH值，只有当PH接近6.7时粉末才能完全溶解，此时当小心少量地加入KOH直至达到所需PH值。

转 化

1.      取100μl感受态细胞于冰浴上融化。

2.      加入1μl纯质粒或连接产物，轻轻吹打混匀，冰浴30 min。

3.      将菌液放入42℃水浴中热激90秒，立即放入冰浴中2 min。

4.      加入0.9ml SOC，于37℃恒温摇床上200rpm×1hr温育。

5.      将菌液4000rpm/min离心3min，留200μl上清将菌体打散，均匀涂布于含适当***的琼脂平板表面，平板于37℃倒置培养过夜。

                        i.              注：新倒的平板可于37℃培养箱中预先放置数小时至过夜干燥。

     ii.   当转化的是TA克隆连接产物时可在菌液中加入8μl 1M IPTG和40μl  20mg/ml X-gal以进行蓝白斑筛选。

重组子的筛选和鉴定

重组子可通过酶切进行鉴定，也可以利用扩增引物通过PCR进行鉴定，阳性重组子能切出所需要的片段或得到相应片段的PCR产物。

1.      用牙签挑取平板上的菌落接种于2ml含适当***的LB培养基中，37℃摇床培养过夜。

2.      次日取菌液0.2-0.5ml，13,000rpm×3min离心，弃上清，加入20μl  ddH₂O和20μl 酚/氯仿，震荡混匀，13,000rpm×5min离心。

3.      取上清进行琼脂糖电泳，加入载体质粒DNA作为阴性对照，根据质粒大小初步筛选重组子，重组子的泳动速度应该慢于载体质粒。

4.      用碱法小量制备可能是重组子的质粒DNA。

5.      选取适当的酶，对重组子进行酶切分析，酶切体积均为10μl体系。酶切样品进行琼脂糖电泳鉴定是否有所需片段。

6.      酶切分析正确的重组子分成两份，一份进行测序反应，另外一份保种。

7.      若用PCR法鉴定，则在第2步时每个样本取0.5-1.0μl 菌液为模板进行PCR反应，每管反应体系*低可少至10μl，PCR产物电泳，能得到所需条带的样本进一步提取质粒酶切鉴定或送样品测序。

真核细胞的转染

该操作以Invitrogen公司的脂质体转染试剂LipofectAMINE  为例，其它转染试剂可参照各自的使用说明书进行。

1.      在6孔板中接种1-3×10⁵细胞/孔，加入2ml完全培养基，置CO₂孵箱中37℃培养过夜。

2.      待细胞长到50-80%单层时，在无菌离心管中配制如下溶液：

                        i.              溶液A：将1-2μg待转染的超纯DNA稀释到100μl无血清培养基中

                      ii.              溶液B：将2-25μl  LipofectAMINE稀释到100μl无血清培养基中

3.      混合溶液A和B，轻轻混匀，室温放置15-45min。

4.      用2ml无血清培养基轻轻洗涤细胞，加入0.8ml无血清培养基/孔，将脂质体复合物滴加到孔中，轻轻摇晃混匀，置CO₂孵箱中37℃孵育2-24hr。

5.      用完全培养基替换转染液，继续培养。

6.      24-72hr后检测蛋白质的表达或传代并加入选择性***以筛选稳定表达株。

转染细胞的稳定筛选

1．确定***作用的*佳浓度：

不同的细胞株对各种***有不同的敏感性，因此在筛选前要做预试验，确定***对所选择细胞的*低作用浓度。

1)        提前24小时在96孔板或24孔板中接种细胞8孔，接种量以**天长成25%单层为宜，置CO₂孵箱中37℃培养过夜。

2)        将培养液换成含***的培养基，***浓度按梯度递增（0, 50, 100, 200, 400, 600, 800 和1000μg/ml）。

3)        培养10-14天以绝大部分细胞死亡浓度为准,一般为400-800μg/ml,筛选稳定表达克隆时可比该浓度适当提高一个级别维持时使用筛选浓度的一半.

2．转染按前面的步骤进行。

3．转染72小时后按1:10的比例将转染细胞在6孔板中传代，换为含预试验中确定的***浓度的选择培养基。在6孔板内可见单个细胞，继续培养可见单个细胞分裂繁殖形成单个抗性集落，此时可用两种方法挑选单克隆。

1)      滤纸片法：用**的5x5mm滤纸片浸过胰酶,将滤纸片贴在单细胞集落上10-15秒，取出粘附有细胞的滤纸片放于24孔板中继续加压培养。细胞在24孔板中长满后转入25cm²培养瓶中,长满后再转入75cm²培养瓶中培养。

2)      有限稀释法：将细胞消化下来后做连续的10倍稀释（10^-2—10^-10），将每一稀释度的细胞滴加到96孔板中培养，7-10天后，选择单个克隆生长的孔再一次进行克隆。

4. ELISA或Western blot检测单克隆细胞中外源蛋白的表达情况由于不同克隆的表达水平存在差异因此可同时挑选多个克隆选择表达量*高的克隆传代并保种。                                                   

重组蛋白质的表达、纯化、复性和定量

按Qiagen公司的操作手册进行，具体步骤如下。

一、重组蛋白质的诱导表达

1.      挑取转化有质粒的单菌落，接种于3ml 选择性LB液体培养基中，37 ^oC，250 rpm/min振摇培养过夜。

2.      次日将培养过夜的菌液500 μl再接种于10 ml（1:20）选择性LB液体培养基中，37 ^oC，250 rpm/min振摇培养至光密度（OD₆₀₀=0.6）时，取1 ml样本作为诱导前标本，10000g离心1 min收集菌体沉淀，－20 ^oC冻存备用。

3.      加入1 mol/L IPTG于菌液中，使IPTG终浓度为1 mM，37 ^oC，250 rpm/min振摇培养4～5小时。取1 ml样本作为诱导后标本，同上法收集菌体沉淀，－20 ^oC冻存备用。

4.      将诱导前后菌体沉淀用20 ~ 40 μl PBS（pH= 8.0）重悬，加入等体积的2×SDS上样缓冲液，煮沸加热5 min，SDS聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳分离，考马斯亮蓝染色3小时后，脱色观察结果。

5.      选取诱导成功的**克隆，扩大诱导规模，收集菌体沉淀，于－20 ^oC保存，准备做下一步分析及纯化。

二、重组蛋白质的分离纯化

重组蛋白质的可溶性鉴定

1.      将按上法诱导培养后收集的菌体重悬于裂解液1 (Lysis buffer under native conditions )中，然后在－80 ^oC低温冰箱中放置10 min。

2.      冰中解冻。

3.      在冰浴上用超声破碎仪破菌6次，每次10 sec，间歇10 sec，电压200-300 V。

4.      10000g，4^oC，离心20 min，取上清（为溶液A），－20 ^oC保存；另将沉淀用同样裂解液1溶解（为溶液B），同样－20 ^oC保存，供后继分析使用。

5.      将上述A、B溶液和诱导前后的**进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，比较分析重组蛋白质的溶解性。如果诱导表达的蛋白质位于A溶液中，则为可溶性蛋白；如果是在B溶液中，则为非可溶蛋白。

重组蛋白质为非可溶性蛋白（变性条件下）的分离纯化

1.      将菌体沉淀溶于适量裂解液2（Lysis buffer under denaturing conditions）中，室温下搅拌和吹打沉淀，避免泡沫生成。

2.      10000g，4 ^oC，离心30 min，收集上清液。

3.      将Ni-NTA Agarose充填柱子，并连接于Pharmarcia低压液相层析系统，用5倍柱体积的裂解液2平衡Ni-NTA Agarose，调节A₂₈₀值至零线。

4.      将适量上清液上样到Ni-NTA Agarose柱子中，并用lysis buffer冲洗至A₂₈₀值低于0.01。

5.      分别用5～10倍柱体积的清洗液1 和清洗液2（Wash buffer 1 and 2）清洗柱子，直至A₂₈₀值低于0.01。

6.      用洗脱液（Elution buffer）洗脱重组蛋白质，在A₂₈₀值监测下，收集出现峰线后含有重组蛋白的所有洗脱液。

三、重组蛋白质的复性、冻干和定量

纯化后的蛋白用梯度降低的尿素溶液缓慢透析，*终用0.01×PBS透析，透析后的蛋白质溶液经冻干成粉状。以牛血清白蛋白(BSA)为标准，采用BIO-RAD公司蛋白质定量试剂(protein assay)比色测定蛋白质的含量。

肿瘤细胞体外传代培养及保种

一. 细胞复苏与培养

将液氮或-80^oC保存的肿瘤细胞于37^oC 水浴, 快速溶化, 用8.0ml培养基混匀已融化的肿瘤细胞悬液, 于1500转/分, 离心3分钟。弃上清, 再吸取8.0ml培养基质混匀细胞沉淀, 再1500转/分, 离心3分钟, 弃上清, 细胞沉淀用1.0ml培养基混匀, 备用。 另取一个75cm²方瓶, 加入14.0ml培养基质, 将上述制备的含肿瘤细胞悬液(1.0ml)加入此方瓶中, 于37^oC，5%CO₂孵育箱中培养。

若此肿瘤细胞悬浮生长, 大约3－4 天细胞基质会变黄, 5.0ml细胞悬液可传代一个方瓶培养, 可用3－4个方瓶培养, 一个方瓶中呈对数生长的肿瘤细胞可达1—1.5×10⁷ 个, 根据试验所需, 可决定传代的次数。 若此肿瘤细胞呈贴壁生长, 经过3—4天, 肿瘤细胞生长至80%—95% 单层时, 弃上清, 用0.5mM 的EDTA(难消化的肿瘤细胞用0.25%胰酶1.0ml), 处理肿瘤细胞大约 3—5分钟, 用倒置显微镜观察，当90% 的肿瘤细胞变圆时, 即可用弯管吹打并将消化的细胞转移到15ml离心管中, 于1500转/分下，离心3分钟, 弃上清, 加少许培养基混匀, 可传代3个75cm²方瓶扩大培养。

二. 细胞冻存

    将对数生长的肿瘤细胞用1个75cm²  方瓶按上述方法收集, 于1500转/分 离心3分钟,弃上清, 用保种液(含10% DMSO的小牛血清)3.0ml混匀, 分别加入到2—3只保种管中, 写上肿瘤细胞名称, 时间, 保种者姓名, 放-80^o C 保存, 次日将它们转移到液氮中保存(注: -80^o C下可保存细胞半年至一年, 液氮可保存细胞5—10年, 甚至更长的时间)。以上所有物品均需经过高温**( 121^oC, 30分钟)，培养基质则经过过滤(0.22uM)**, 所有操作均必须遵守无菌操作技术, 避免**、**、病原体、衣原体等污染。

肿瘤动物模型的建立

将对数生长的肿瘤细胞收集, 用无血清基质10.0ml, 于1500转/分, 离心3min, 连续洗3次, *后用无血清基质混匀, 用血球计数器计算肿瘤细胞数量(平均5个中方格的细胞计数×10⁴ 即是肿瘤数/毫升)。 计算完肿瘤细胞总数, 再将肿瘤细胞密度调至4×10⁶ 个/ml, 每只小鼠腋下接种50ul(即2×10⁵个肿瘤细胞), 2周左右可扪及肿瘤小节结。一般选取6—8周的小鼠，不同的肿瘤细胞接种的数量和动物不一样, 比如LL/2, B16, Hepa 可接种C57和BALB/C 小鼠, NS-1, EL-4, C26, Meth A可接种BALB/C 小鼠, H22接种昆明鼠。从肿瘤接种后可扪及小结节开始, 每3天用游标卡尺量肿瘤纵横大小(单位: mm), 至少连续一个月时间。注意要设计不同的实验组和对照组, 每组动物数一般为5—10只, 一般接种肿瘤6—8周后，小鼠的肿瘤可生长至直径为15—20mm (即小鼠会濒临死亡)时, 可眼球取血，分离血清并保存血清, 处死小鼠, 取肿瘤组织照相, 取部分肿瘤组织作冰冻组织切片(或-80℃ 保存), 作相应的**组织化学染色, 取部分肿瘤组织用3%中性的甲醛固定, 石腊包埋, 作常规HE染色.

小鼠尾静脉注射方法

在靠近实验台边缘处, 用大培养皿扣住小鼠, 左手抓住小鼠尾巴, 用酒精棉球擦尾巴, 可见到两侧静脉; 注射前应确认针管内无气泡, 注射时由尾尖开始, 顺向刺入。失败后再逐渐移向根部重刺, 若准确刺入静脉内, 推进时无阻力, 一般可注入0.1—0.5ml。

肿瘤蛋白疫苗预防性动物实验

    一般肿瘤蛋白疫苗****剂量10ug/只小鼠, 与相应佐剂混匀, 在背部皮下注射, 第2次**间隔2周, 同样加佐剂在皮下注射； 第3次**间隔2周, 同样加佐剂在皮下注射；第3次**后2周, 用ELISA检测其血清效价，当效价达到要求时；在接种肿瘤细胞前3天,于腹腔或尾静脉加强注射20ug /只。

人脐静脉内皮细胞（HUVEC）培养

1.      将15-20cm长的新生儿脐带放入无菌的PBS溶液中储存。

（注：4℃下*多贮存24小时，室温下不超过6小时，否则废弃）

2.      用一个钝头的针头扎入脐带静脉管中，用无菌的PBS溶液冲洗3-5次，将污血冲洗干净为止。

3.      用手术钳夹紧脐带下端，加入15ml 的胶原酶（1mg/ml）室温下消化15-20分钟，并不时上下摇动脐带。

4.      消化完后，将下端手术钳松开，消化液流入一个50 ml无菌离心管中，用无菌的PBS溶液冲洗脐带2-3次。

5.      将收集液离心（2000转/分）3分钟。

6.      倒去上清，加入10ml M199培养基（加入10U/ml的bFGF），用弯管吹散细胞，将所有液体转入一个用明胶包被好的培养瓶中，37℃培养。

（注：每个培养瓶中加入3-4ml无菌的1%的明胶溶液，摇匀使得明胶溶液完全铺满瓶底，放入37℃孵育，*少2小时，用前将明胶溶液倒了即可，明胶包被有利于细胞贴壁。）

7.      培养24小时后，倒掉培养基，并用无菌的PBS溶液清洗2-3次，洗掉红细胞和死细胞，加入10 ml新鲜的 M199培养基。

8.      以后每2天换一次培养基（每次换掉2/3的培养基）。

9.      一般培养5-7天，细胞可长满至80-90%单层，这时可以传代。

10.  倒掉培养基，用无菌的PBS溶液清洗2-3次，加入2-3ml消化液（0.25%胰酶+0.1%EDTA）消化细胞，在显微镜下观察，一旦细胞变圆，即加入2-3倍的有血清的DMEM培养基终止反应。

11.  用弯管将细胞吹打下来，并将所消化的细胞转移到一个50 ml无菌离心管中，2000转/分，离心3分钟。

12.  倒掉上清,加入10ml新鲜培基,一般一瓶细胞可传代3-4瓶.以后照此传代培养.

13.  一般传代2-3代（培养了20天左右）用于做各种实验效果*好。

实验动物**方案

1、抗原: 蛋白质、多肽、细胞器、细胞、组织等。

2、**方式：皮下注射、腹腔注射、静脉注射、肌肉注射等。

3、不同动物**所需抗原量（以蛋白**为例）

>18-20kDa                  <18-20kDa

动物     抗原量    *佳抗原量     抗原量    *佳抗原量

兔子     20-200        100         50-400       200

小鼠     2-40          15           4-60         40

大鼠     10-50         30          20-150        50

绵羊    100-1000       200         200-1000      400

母鸡     20-200        100          50-400       200

单位：微克

4、**方案（以**兔子为例）：

天数    0       14       28       38      56      66        87

注射    x        x        x                x

采血   2ml                        2ml           2+20ml     2+50-70ml

5、注意：

²  **次**用完全佐剂与**原混合，以后加强**用不完全佐剂与**原混合，采取多点，时间间隔式**法。

²  如果用细胞**兔子，那么每次**所需细胞量为2-3 x 10⁷ cells。

²  在连续**完三次后，需要少量取血进行ELISA检测，检测所**动物的抗体滴度，一般滴度能达到1:10,000-50,000。在处死所**的动物前一周应加强一次**。

²  如果用小鼠**，可以尾静脉小量采血（大约50µl），*后取眼球大量采血（大约500-1000µl）；如果用兔子**，可以耳缘静脉小量取血(大约2mL)，*后心脏大量取血(50-100mL)

²  按血清制备的标准方法将血清分离，并且分装成小份，储藏在-80^oC。

血清制备

1.        取血后，37^oC下，让血液凝固1到2小时（不加抗凝剂）；

2.        4^oC冰箱过夜（让血块固缩）；

3.        当血清自然析出后， 4^oC，3000转/分，离心10分钟，分离血清，弃去不溶物；

4.        将血清移至一干净试管，并分装成小份，储藏在-80^oC。

ELISA

一、包被抗原

1.      用50mM的碳酸盐包被缓冲液（pH 9.6）溶解抗原，使抗原浓度为10-20 μg/ml，加100 μl/孔到96孔酶标板，4 ^oC放置过夜。

2.      **天弃去包被液后，用PBST洗涤3次，每孔加入150 μl 1％ BSA 37 ^oC封闭1小时。

3.      PBST洗涤3次后，每孔加入100 μl不同倍比稀释度的血清，并加入对照样品，37 ^oC孵育2小时。

4.      PBST洗涤5次后，加入100μl稀释后的HRP标记的二抗，37 ^oC孵育1小时。

5.      PBST洗涤5次后，显色剂显色20 min后，酶标仪上读取A₄₀₅吸收值。

二、包被细胞

1.      在96孔培养板上接种细胞数为1 x 10⁴ cells/well，37℃过夜培养。

2.      **天用PBS洗涤培养板2-3次。

3.      加入125 µl/well 10% Formalin（1:10稀释）, 室温下固定15 min。

4.      用ddH₂O洗涤培养板3次，并晾干，储藏在2-8^oC备用。

5.      用PBST洗涤3次，每孔加入150 μl 1％ BSA 37 ^oC封闭1小时。

6.      PBST洗涤3次后，每孔加入100 μl不同倍比稀释度的血清，并加入对照样品，37 ^oC孵育2小时。

7.      PBST洗涤5次后，加入100 μl稀释后的HRP标记的二抗,37 ^oC孵育1小时。

8.      PBST洗涤5次后，显色剂显色20 min后，酶标仪上读取A₄₀₅吸收值。

  50mM的碳酸盐包被缓冲液：0.05mol/L pH9.6碳酸缓冲液,4℃，保存,　Na₂CO₃ 0.15克, NaHCO₃ 0.293克,蒸馏水稀释至100 ml。

  ABTS作为底物进行显色反应(10ml)：

²  0.2M  Na₂HPO₄  2.4ml

²  0.1M  柠檬酸2.6ml

²  ddH₂O   5ml

²  ABTS  5mg

²  H₂O₂(30%)  4 ul（用前加入）

注 意：

²  一般做倍比稀释进行检测，需要有相应的对照血清。

²  不同的显色系统对应不同的光吸收值。

血清学筛选克隆新抗原/新基因

一、E.coli/ phage 裂解液预吸附血清

1.        将E.coli /phage lysate以1:10-20稀释在TBST溶液中。

2.        将4张82mm的nitrocellulose membranes（NC）浸入稀释后的E.coli/ phage lysate中，室温下水平摇动30分钟，取出NC并使膜沥干。

3.        用50ml TBST溶液洗膜3次，每次10分钟。

4.        用滤纸轻轻吸去膜上的液体。

5.        将膜放入50ml封闭液中，室温下水平摇动*少30分钟。

6.        将膜从封闭液中取出，用50ml TBST溶液洗膜3次，每次10分钟。

7.        将血清按1:5稀释在TBST溶液中，将一张膜放入溶液中，37℃下轻轻水平摇动10分钟。

8.        从血清稀释液中取出膜并丢弃,加入另外一张新膜,37℃下轻水平摇10分钟.

9.        重复步骤8，直至所有4张膜都处理完。

10.    除去*后一张膜，收集血清（primary antibody），分装成小份储存于-80℃冰箱中待用。

注意：

²  该步处理过程是为了去除血清中能与**和噬菌体裂解蛋白进行**反应的抗体，这样可以减少假阳性率；

²  一抗不能反复冻融，化冻后不要再次冰冻，可放于4℃作短暂保存；

²  可以是病人血清，也可以是**血清，如果是病人血清，则需要至少10个病人血清进行混合；

二、噬菌体筛选

1.        准备NZY agar plates（至少用前24小时倒好），用前在37℃培养箱中烘烤1-2小时以去除水滴。

2.        将过夜培养的XL1-blue MRF’**2000转/分，离心10分钟，将**溶解在10mM MgSO4中，调整**浓度为OD₆₀₀=0.5。

3.        融化NZY top，并将NZY top放在50℃水浴中。

4.        将适量的XL1-blue MRF’**溶液与一定稀释度的phage文库混合，37℃下共同作用15分钟。

²  直径90mm平板：200µl XL1-blue **+适量的phage文库

²  直径150mm平板：600µl XL1-blue **+适量的phag文库

（噬菌斑数量一般保持在3000pfu/90mm; 12000pfu/150mm）

5.        将步骤4中的混合液与NZY top溶液混合（200µl混合液+3-4mlNZY top溶液；600µl混合液+8-10 ml NZY top溶液），倒入到NZY agar plates中，室温下放10分钟左右，然后倒置放于37℃下培养。

6.        当噬菌斑刚好可看到时（大约5-8小时），从培养箱中拿出平板。

7.        将NC放入10mM IPTG溶液中完全浸湿，在空中使膜沥干，并做好3个不对称的标记。

8.        将IPTG处理好的NC贴在平板上，不留气泡，然后倒置放于37℃下培养。

9.        过夜培养后，**天早上取出平板，用镊子将膜轻轻掀起，注意不要将培养基粘在膜上。

10.    将膜放于50ml TBST溶液中，水平脱色摇床上震荡洗膜3次，每次10分钟。

11.    将膜放入50ml封闭液中，水平摇动，封闭4-6小时。

12.    在封闭液中加入适当滴度的一抗，水平摇动处理过夜。

13.    将膜放于50ml TBST溶液中，洗膜3次，每次10分钟。

14.    在封闭液中加入适当滴度的二抗（各个公司的二抗使用滴度不同），室温水平摇动1-2小时。

15.    将膜放于50ml TBST溶液中，洗膜3次，每次10分钟，*后用50ml TBS溶液洗膜15-20分钟，取出膜空气中沥干。

16.    将膜放入BCIP-NBT显色液中避光显色，水平摇动直到阳性斑点可见为止。

17.    从显色液中取出膜放在TBS溶液中，空气中使膜干燥。

18.    根据所做的标记,将膜与平板对齐,将平板上对应的阳性克隆区域的培养基挖出放入500µl SM buffer中,并加入25 ml chloroform,4℃贮存（*多可贮6月）。

19.    **轮筛选得到阳性克隆需要进行**轮筛选以去除假阳性并获得阳性单克隆噬菌体。过程如**轮筛选，只不过用直径90mm平板；具体过程见步骤4，这时所加入的噬菌体溶液是**轮筛选得到的噬菌体上清（见步骤18），在用前要滴定好噬菌体的滴度，噬菌斑的数量以可区分出单个克隆，同时密度不能太稀为标准（一般100-200 pfu/90mm）。

20.    按**轮相似的过程进行实验，*后显色，确定真正的阳性克隆，并将阳性单克隆所在的培养基挖出放入500µl SM buffer中，并加入25 ml chloroform，4℃贮存（*多可贮存6月）。

注意：

²  封闭液一般可用：5%的脱脂牛奶或1%的BSA溶解在TBST溶液中。

²  **轮筛选用150mm的平板；**轮筛选用 90mm的平板，一般需要筛选至少1 x 10⁶ pfu。

²  认真做好三个不对称的标记，特别在**轮挑选阳性克隆时要仔细将膜与平板吻合好，不能挑错。

三、单克隆剪切

1.        取**轮筛选得到的阳性克隆贮存液上清。

2.        将过夜培养的XL1-blue MRF’**2000转/分离心10分钟，将**溶解在10mM MgSO4中，调整**溶度到OD₆₀₀=1.0。

3.        在一个EP管中加入：200µl XL1-blue MRF’**+250ul phage stock（步骤1）+1 ul ExAssist helper phage。

4.        将以上三种样品混合，37℃下共同保温15分钟。

5.        将样品混合物加入到3 ml LB培养基中，37℃震荡培养3-4小时。

6.        将试管放于65-70℃水浴20分钟，3000转/分，离心15分钟。

7.        将上清转入新的离心管中，已发生剪切的phage particles在上清中（上清可在4℃下储存1-2月）。

8.        将100ul phage 上清+200ul SOLR cells（OD₆₀₀=1.0）混合，37℃保温15分钟。

9.        取步骤8中溶液5-10 ul涂于LB-amp agar plates（amp=50ug/ml），过夜培养。

10.    **天**长出，随机挑取单克隆接种到LB-amp培养基中培养过夜。

11.    过夜培养**分为三部分：（1）提取质粒做双酶切，鉴定外源基因的大小；（2）送样品进行DNA测序（3）加入30-40%的甘油进行保种，分装成小份储存于-80℃备用。

附录：

1、SM buffer (1L):

(5.8 g NaCl+2.0 g magnesium sulfate+50 ml 1M Tris (pH=7,5)+0.1 g gelatin)
2、AP-buffer:

(100 mM Tris HCI (pH 9.5) ;  100 mM NaCl ;  5 mM MgCl₂)

3、10xTBS（1L）：

（0.1 M Tris-HCl (pH 8.0)；1.5 M NaCl）

4、LB Broth（1L）：

（10 g NaCl+10 g of tryptone+5 g of yeast extract）

ELISPOT

1.      PBS溶解抗原为30 μg/ml，加100 μl/孔于PVDF膜铺底的96孔**板过夜；

2.      **天吸去包被液后，加5％FCS的PRMI 1640培养基100 μl封闭1小时，37 ^oC；

3.      准备脾细胞悬液（用氯化铵去除红细胞，制备成单个脾**细胞悬液）；

4.      从1 × 10⁶/孔开始，按1:3的稀释度开始逐孔稀释做不同浓度梯度，并做3个复孔，37 ^oC静置培养5小时；

5.      PBS洗3～5次，生物素化的抗鼠IgG二抗孵育30 min；

6.      PBS洗3～5次，链亲和素标记的碱性磷酸酶孵育30 min；

7.      PBS洗3～5次，用底物BCIP/NBT显色，显微镜下观察显色反应，显色后及时终止反应；

8.      计数每孔中的斑点数目，计算每10⁶个脾细胞中抗体分泌细胞数量。

藻酸盐包裹实验

1.      将藻酸钠溶于无菌生理盐水，终浓度为1.5%；

2.      收集培养的肿瘤细胞，用无血清的培养基洗涤1次，将细胞沉淀重悬于1.5%藻酸钠溶液中；

3.      将上述肿瘤细胞悬浮液用1 ml加样枪缓慢滴入磁力搅拌的250 mM CaCl₂溶液中，形成乳白色的藻酸盐小珠。继续静置于250 mM CaCl₂中30 min即可使用。以上操作步骤均在无菌条件下进行；

4.      将第4次**后7天的小鼠用****钠0.1ml (按100 mg/kg计) 腹腔注射麻醉，小鼠麻醉后置于解剖台上，切开背部皮肤，皮下植入4粒藻酸盐包裹颗粒，缝合皮肤，外敷手术胶膜；

5.      天以后，小鼠经尾静脉注入100 μl (按100 mg/kg计) FITC标记的葡聚糖(FITC-Dextran)；

6.      20 min后处死动物，取出藻酸盐颗粒，常温下加入1 ml的生理盐水，剪碎研磨颗粒，再加入1 ml的生理盐水,混匀标本，放置1小时，1500 rpm离心5 min。取上清液用荧光酶标仪测定；

7.      用不同浓度的FITC-Dextran制备标准曲线。

重组腺病毒构建，扩增及纯化基本技术操作

（**内同源重组AdEasy System）

一 目的基因的克隆（以pshuttle-CMV质粒为例）

1.      选择适当酶切位点，进行酶切连接，将目的片段插入pshuttl-CMV质粒多克隆位点。

2.      重组质粒鉴定： 酶切鉴定或测序。

3.      重组质粒扩增，纯化并准备适量含目的基因的穿梭质粒。

4.      用PmeI单酶切线性化重组穿梭质粒，电泳鉴定质粒完全被切开。

5.      胶回收线性化质粒，以备共转化使用。

二 共转化

1  大肠杆菌BJ5183电转感受态制备

²  从新鲜琼脂板上挑取单个BJ5183**，接种于LB培养基中，37℃振摇过夜。

²  接种25ml过夜培养物于500ml LB培养基，37℃振摇，至OD₆₀₀ 达到0.4。

²  迅速将培养物置于冰浴中30min，至充分冷却。

²  将菌液转移至预冷的离心管中，4℃下以2500r/min离心15 min，弃培养液，回收细胞。

²  以10ml预冷的10%甘油洗涤沉淀，低温离心，共两次。

²  加约1ml（适量）预冷的10%甘油重悬沉淀，稀释悬液100倍，测量OD_600，至稀释浓度为2-3×10¹⁰个细胞/ ml (1.0 OD₆₀₀约2.5×10¹⁰个细胞/ml)。分装，-80℃或液氮保存待用。

2  病毒骨架质粒转化大肠杆菌，扩增，纯化。

3  将1-5µl (约1µg) 线性化的穿梭质粒及1µl（约100ng/µl）病毒骨架质粒（如pAdEasy-1）加入至含约40µl BJ5183电转感受态的EP管中混匀,冰上冷却。

4  将混合物加入电转杯，电击（1250-1500V/mm,5ms）。

5  电击结束取出样品，加入1ml SOC或LB培养液，37℃低速振荡40min。

6  取适当体积的电击转化细胞液涂于数个卡那霉素抗性平板（25-50mg/ml），37℃培养16-20hr。

7  次日挑取平板上长出的菌落（选择*小的菌落）,接种于3ml含25-50mg/ml的LB培养基，37℃培养10-15hr。

8  碱裂法提取质粒，0.8%琼脂糖凝胶电泳筛选，大质粒为可能阳性克隆，进一步酶切鉴定。以PacI单酶切，0.8%琼脂糖凝胶电泳如显示出一条大片段（约30kb）,及一条小片段（约3.0或4.5kb）（同时可进行其它酶切鉴定），则基本确定为阳性克隆。

9  取1-5µl 阳性质粒转化至DH5α大肠杆菌细胞（BJ5183为recA+,质粒DNA易发生突变，DH5α或JM109，XL1-blue菌株为重组缺陷性菌株，可稳定扩增已鉴定的重组质粒），扩增**并纯化质粒。

三 重组病毒质粒转导293细胞

1  293细胞培养：转导24小时前，以方瓶为例，接种2×10⁶  293细胞于25cm²方瓶，使生长密度约50-70%。（也可以使用6孔或96孔板）

2  以PacI单酶切重组病毒质粒（转导25cm²方瓶约需4µgDNA），完全线性化后，乙醇沉淀，再以20 µl ddH₂O溶解。

3  脂质体包裹质粒（以Lipofectamine为例）:每4µg PacI约需20µl Lipofectamine包裹.质粒及脂质体分别稀释于500µl无血清培养基再混合,置于室温下15-30min。

4  以无血清培养基轻轻洗涤培养瓶，另加2.5ml无血清培养基，37℃放置10min。

5  将Lipofectamine-DNA混合物加入培养瓶，37℃孵箱放置4hr。

6  4hr后，弃Lipofectamine-DNA混合液，另加入6ml DMEM完全培养基（含10% FCS）。如有大量细胞漂浮，可不弃Lipofectamine-DNA液，加入6ml DMEM完全培养基，37℃孵育过夜，再换液。

7  培养过程中观察细胞生长情况。约2周后可观察到细胞病变（CPE）出现（如用pAdTrack-CMV质粒，由于含GFP，可观察到绿色荧光）。

四 重组病毒鉴定

1  转导10-14d后，收集细胞沉淀，加入2ml**的PBS混悬，冻融细胞，离心后收集上清保存于-80℃。

2  取30-50% 步骤1中上清，感染50-70%饱和度的25cm²方瓶中293细胞。2-3d后出现明显细胞病变。

3  感染后3-5d,当1/3-1/2细胞漂浮时收集病毒。按步骤1收集细胞并准备病毒上清。通过Western blot和/或PCR鉴定重组腺病毒产生。

4  PCR鉴定重组病毒。取5µl病毒上清加入10µl蛋白酶K，55℃孵育1hr，再煮沸5min，离心后取1-2µl作PCR。

五 重组病毒扩增，纯化

1  75cm²方瓶中接种293细胞，至密度达到90%，加入适量病毒上清感染细胞。3-4d后，细胞几乎变圆，且有一半细胞漂浮，则收集所有细胞。约500g转速离心，弃上清。

2  以**PBS重悬沉淀，反复冻融4次。4℃下7000g离心5min.病毒纯化至少需要30瓶75cm²方瓶细胞。

3  CsCl连续梯度离心纯化：50ml离心管中称量4.4g CsCl，加入8ml病毒裂解上清液，混匀，体积约为10ml。转移至12ml超速离心管（用于SW41转头）中，覆盖约2ml矿物油。平衡后，10℃下32000 rpm离心18-24hr，用注射器抽吸离心出的病毒带。

（也可CsCl不连续梯度离心：20ml超速离心管中缓慢加入8ml CsCl 1.4 (53 g + 87 mL 10 mM Tris-HCl，pH=7.9)，上面小心加入6 mL CsCl 1.2 (26.8 g + 92 mL 10 mM Tris-HCl，pH=7.9)，再小心加入病毒上清液至体积达到20ml。平衡后，4℃下 23000rpm离心90min (SW28转头)，用注射器抽吸下层蓝白色病毒带）

4  病毒透析去盐：配置透析液（10 mM Tris pH 8.0, 2 mM MgCl₂, 5% sucrose），**处理。4℃透析，更换3次透析液，可基本去除CsCl，病毒保存于-80℃。

六 病毒滴度测定（TCID50）

1  细胞准备:96孔板中接种100µl 293细胞,每孔细胞数约10⁴个,以2% DMEM培养

2  稀释病毒液准备：以2% DMEM将病毒液稀释成8个较高浓度（如10^-3-10^-10），每个浓度重复10个，每孔加入病毒稀释液100µl。另留两排不加病毒液作为阴性对照。37℃下，孵箱培养10天。

3  10d后观察细胞，记数每排出现CPE的孔数，计算细胞病变率。（如某一浓度各孔细胞全部病变，比率为1，如无细胞病变，则比率为0）。

4  计算T =10×10^{1 + d (S - 0.5)} /ml

d = Log 10 稀释度（如为10倍稀释℃，d=1）

   S = 各浓℃细胞病变比率之和

实验室重组腺病毒常用质粒：病毒骨架质粒：pAdEasy-1, pAdEasy-2

穿梭质粒：p-Shuttle, p-Shuttle-CMV, pAdTrack, pAdTrack-CMV

组织病理技术

组织处理：

1.        取新鲜组织厚度不超过5mm，10% 中性福尔马林固定，大于24小时。

2.        固定后冲水12-24小时，

3.        75%酒精，   1次，1小时，

4.        85%酒精，   1次，1小时，

5.        95%酒精，   3次，1小时，

6.        100%酒精，  3次，1小时，

7.        二甲苯，     2次，1小时，

8.        石蜡浸泡，   3次，2小时，

HE 染色：

   {水化}

1.        二甲苯，     2次，5-10分钟，

2.        100%酒精，  1次，1-2  分钟，

3.        95%酒精，   1次，1-2  分钟，

4.        85%酒精，   1次，1-2  分钟，

5.        75%酒精，   1次，1-2  分钟，

6.        过蒸馏水，

   {染色}

1.        Mayer 氏苏木素，1   分钟，

2.        温水冲洗，      5-10 分钟，

3.        75% 盐酸酒精， 1-2  分钟，

4.        自来水冲洗，    30  秒钟，

5.        依红复染，      1-2  分钟，

6.        自来水洗，      30  秒钟，

7.        85%酒精，      1次，1-2  分钟，

8.        95%酒精，      2次，1-2  分钟，

9.        100%酒精，     2次，1-2  分钟，

10.    二甲苯，       2次，5-10分钟，

11.    中性树胶封片。

**组化染色

一．石蜡切片**组化染色实验步骤：

  1．石蜡切片脱蜡至水：（石蜡切片染色前应置60℃ 1小时）。

   （1）二甲苯I、II,各10分钟。

   （2）梯度酒精：100%，2分钟® 95%，2分钟® 80%，2分钟® 70%2分钟。

   （3）蒸馏水洗：5分钟，2次（置于摇床）。

  2．过氧化氢封闭内源性过氧化物酶：3%H₂O₂，室温10分钟（避光）。

  3．蒸馏水洗：5分钟，2次（置于摇床）。

  4．抗原修复：根据待检测的抗原，选择适当的方法。

附：抗原修复液（10mM pH 6.0枸橼酸钠缓冲液）的配制

    （1）储备液的配制：  

           A液：枸橼酸三钠-2H₂O 29.41g + 蒸馏水1000ml              

           B液：枸橼酸 21g + 蒸馏水1000ml                  

       （2）工作液的配制：A液82ml + B液18ml + 蒸馏水900ml

      抗原修复的方法：

（1）高压锅处理技术：枸橼酸钠缓冲液（10mM，PH6.0）,淹没切片,盖                 上锅盖，高压锅内煮沸,上汽3分钟后缓慢冷却（可用自来水在高压锅外冲，以助冷却）。

（2）微波处理技术:用塑料切片架,置于塑料或耐温玻璃容器内，枸橼酸钠缓冲液淹没切片，选择中高或**,5分钟;取出并补充已预热的枸橼酸钠缓冲液；再选择中高或**,5分钟.（*佳温度为92~95℃）

   （3）酶消化处理：此略。

  抗原修复的注意事项：

   （1）组织不能干。

   （2）选择抗原修复方法要因抗体而异。

   （3）该方法主要用于10%福尔马林固定、石蜡包埋组织。

   （4）抗原修复后至DAB显色的过程中，均需用PBS缓冲液。

   5．PBS：5分钟，2次（置于摇床）。 

   6．正常血清封闭：从染片缸中取出切片，擦净切片背面水分及切片正面组织

      周围的水分（保持组织呈湿润状态）,滴加正常山羊或兔血清（与**抗 体  同源动物血清）处理，37℃，15分钟。

   附：正常血清配制 (或按试剂盒规定的浓度配制)

   按1:20比例,用PBS配制,每张切片需要量按50ml+5ml (10%抛洒量)计算。

   7．滴加**抗体：用滤纸吸去血清，不洗，直接滴加**抗体，37℃ 2小时

     （也可置于4℃冰箱过夜）。

   8．PBS：5分钟，2次（置于摇床）。

   9．滴加生物素化的二抗，37℃，40分钟。 

   10．PBS：5分钟，2次（置于摇床）。

   11．滴加三抗 （SAB复合物），37℃，40分钟。  

   12．PBS：5分钟，2次（置于摇床）。

   13．DAB 显色，镜下观察，适时终止（自来水冲终止）。

   附：DAB的配制

（1）储备液(DAB 25mg/ml)的配制：DAB 250mg + PBS 10ml，待完全溶解后分装成 1ml,100ml,50ml，20ml等，—20℃，冻存。

    （2）工作液：DAB 储备液20ml + PBS 1000ml + 3% H₂O₂  5ml            

   14．自来水（细水）充分冲洗。

   15．苏木素复染，室温，30秒，自来水冲洗。

   16．自来水冲洗返蓝，15分钟。

   17．梯度酒精脱水：

    80%，2分钟 ® 95%，2分钟 ® 100%，2次，5分钟。

   18．二甲苯透明：

    I，II（二甲苯）各5分钟

   19．封片：加拿大树胶（或中性树胶）封片。

二．细胞爬片的**组化染色：

1.        取出细胞爬片，迅速置入冷丙酮固定20 ~30分钟。

2.        蒸馏水浸泡5分钟，2次。

3.        打孔液浸泡5分钟。

4.        蒸馏水浸泡5分钟，2次。

5.        后接前述实验步骤的第6步（正常血清封闭）。

注：第3、4步仅用于检测细胞内抗原，检测细胞膜抗原时不用。

三．冰冻切片的**组化染色：

1.        新鲜组织立即在恒冷冰冻切片机内切片(也可-80℃保存),厚度为5～6mm。

2.        载玻片可不打底，裱片后，立即用电吹风吹干。

3.        如不马上染色，可密封后-20℃保存。

4.        染色前用冷丙酮在4℃固定10-20分钟。

5.        PBS洗2次,每次5分钟,(必要时应用0.1%柠檬酸钠+0.1%triton打孔)

6.        3% H₂o₂灭活内源性过氧化物酶,20分钟,避光;

7.        用PBS 洗2次,每次5分钟;

8.        接前面实验步骤第六步.

四 ．切片的预处理：

1.        洗衣粉液浸泡30分钟，冲洗，晾干。

2.        洗液 （含强酸、高锰酸钾等）浸泡24小时，冲洗，晾干。

3.        APES（1:50 丙酮溶液） 10-20秒（注意：不能用塑料容器及塑料切片架）。

4.        纯丙酮 I，约10秒。纯丙酮 II，约5秒

5.        晾干或烤箱内烤干，备用。

流式细胞仪常用的几种检测方法

一、测定用乙醇固定的DNA的含量

1、培养细胞的DNA含量的测定

制备单细胞悬液于200μl的PBS缓冲液中；

加入2ml预冷的70%乙醇，4℃保存；

 附:细胞固定的一般步骤

1)        取单细胞悬液1～2×10⁶个细胞于PBS（PH=7.2）缓冲液中；

2)        300g离心5分钟，弃上清，反复两次；

3)        重悬细胞于0.5ml PBS缓冲液中；

4)        将细胞悬液放置于2～3ml冷70%乙醇中，混匀，保存于4℃，至少30分钟。在4℃条件下可保存2~3周。

 注意：

²  根据实验的要求，固定剂也可选用1～3%多聚甲醛；

²  将乙醇作为固定剂时，乙醇应预冷至0～4℃；

²  细胞在固定时，固定剂应缓慢滴入细胞悬液中，使固定剂的浓度缓慢增加，并不断震摇，以免细胞成团（特别是用乙醇固定时）。

²  300g离心5分钟，去上清，再重悬于400μl PBS中；

²  显微镜下观察，若有明显的黏附，须再用筛网过滤；

²  加入PI（含Rnase），避光孵育30分钟；

²  上机检测。

2、新鲜组织的DNA含量的测定

1)        用200mg湿重组织用机械法制成单细胞悬液；

2)        500g离心5分钟；

3)        弃上清，重悬于10ml染色-去污剂中；

4)        再过滤，用200目的筛网或70~80μm的筛网过滤；

5)        上机检测。

3、石蜡包埋组织切片的DNA含量的测定

1)        从石蜡包埋切取切片50 μm厚，2~3片，制成单细胞悬液；

2)        用PBS缓冲液洗涤，500g离心5分钟，弃上清；

3)        加入PI液1ml室温避光30分钟；

4)        调整细胞浓度为1×10⁶/ml；

5)        上机检测。

二、细胞凋亡检测及相关分子检测

1、细胞DNA含量分布（由细胞DNA降解方式检测细胞凋亡）

²  收集已固定的单细胞悬液约5×10⁵~1×10⁶/ml；

²  离心除去固定液，3ml PBS重悬细胞;

²  1500rpm离心，5分钟 ，弃去PBS；

²  加PI染液1ml，室温避光20分钟；

²  调整细胞浓度5×10⁵/ml；

²  上机检测。

2、磷脂酰丝氨酸外翻分析检测细胞凋亡

1)        常规制备单细胞悬液,用PBS洗两次.(若为全血要先溶                            血),取约5×10⁶个细胞，1500rpm离心,弃上清,用400μl 1×Binding Buffer重悬；

2)        分成a、b、c、d、e五管，每管约1×10⁶个细胞

a)        阴性对照，不加任何试剂；

b)        阳性对照,加2%多聚甲醛固定30分钟,加AnnexinV 5μl,室温10min,用1×Binding Buffer洗一次,弃上清再加190μl 缓冲液、10μl PI避光15分钟   

c)        加10μl PI，避光孵育15分钟；

d)       加5μl AnnexinV液，室温避光孵育15min；

e)        加10μl PI和5μl AnnexinV液，室温避光孵育5min；

3)        每管各加400μl 1×Binding Buffer。

4)        上机检测。

注意 a. 操作动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞；

b. 操作时注意避光；

c. 反应完毕后尽快检测，*好在一小时内检测。

3、用单克隆抗体APO2.7检测细胞凋亡

1)        放置0.5~1×10⁶个细胞到试管中；

2)        室温离心200g，6min；

3)        弃上清，加入100μl冷的（4℃）在PBSF溶液中含100µg/ml的digitonnin，轻轻地重悬细胞，在冰上孵育20min；

4)        加入2ml冷的（4℃）PBSF液，室温离心200g，6min；

5)        弃上清，加入20μl PE标记的Apo2.7 单克隆抗体和80μl PBSF液，用vortex轻轻震荡，室温避光孵育15分钟；

6)        加入2ml PBSF液，室温离心200g，6min；

7)        弃上清，加入1ml PBSF液重悬细胞；

8)        避光保存，直到流式细胞仪检测。

        PBSF：含2.5% FCS（v/v）和0.01%NaN3（w/v）的PBS。

三、用流式细胞术进行DNA周期分析

     1、方法：同DNA含量检测

     2、注意：

单细胞浓度应约10⁶/ml，以免影响检测的CV值和检测结果；

制备完成后的标本应用光学显微镜检查其质量（如细胞是否聚集或过多碎片），以保证得到足够的细胞含量；

醛类固定会影响PI与核酸的结合。

四、**荧光标记法

1、细胞膜上的**荧光检测法

间接标记法

1)        制备单细胞悬液；

2)        细胞计数，取出1×10⁶个细胞于试管中；

3)        用台盼蓝染色计活细胞数，要求活细胞数 >90～95%；

4)        在试管中加入一抗，（剂量按照说明书的要求），孵育30～60分钟；

5)        PBS洗涤1～2次，1500rpm，离心3分钟，弃上清；

6)        加入二抗，孵育20～30分钟；

7)        PBS洗一次，1500rpm，离心3分钟，弃上清;

8)        加300μl PBS，上机检测(若不能及时上机检测，可加1ml 1%多聚甲醛固定，可放置1周)。

直接标记法

①～③同间接标记法

④在试管中加入荧光标记的抗体，混匀，孵育30分钟；

⑤用PBS洗2次，1500rpm，离心3分钟，弃上清;

⑥加300μl PBS(PH=7.4)，上机检测。

2、 细胞膜内的**荧光标记法

间接**荧光标记法

1)        取已制备好的单细胞悬液，用1～3%的多聚甲醛固定30分钟（也可4℃保存过夜）；

2)        用PBS洗两次，弃上清；

3)        细胞膜打孔，加入0.1%皂素 200μl，室温10分钟；

4)        用PBS洗涤两次；

5)        加入**抗体，室温30～60分钟，或4℃过夜，同时须设阴性对照或同型对照管；

6)        用PBS洗涤两次；

7)        加入二抗（荧光标记的抗体）室温20分钟，避光；

8)        用PBS洗涤1～2次，弃上清；

9)        重悬细胞于500μlPBS中，上机检测。

直接荧光标记法

①～⑤同间接荧光标记法；

加入荧光素标记好的抗体，避光30分钟（同时做同型对照管）；

用PBS洗涤１～２次，弃上清；

加300μl PBS上机检测。

细胞膜上及细胞内双标记法（直标法）

1)        取出已制备好的未固定的单细胞悬液1×10 ⁶个细胞于试管中；

2)        用PBS洗涤两次；

3)        加入用荧光素标记的抗体来标记细胞膜上的抗原，同时加上阴性对照管，室温孵育20分钟；

4)        在试管中加入1％～3％多聚甲醛1ml，固定30分钟；

5)        PBS洗涤两次1500rpm 3分钟，弃上清;

6)        打孔，加入0.1％皂素200μl室温10分钟;

7)        用PBS洗涤两次，弃上清;

8)        加入用荧光素标记的抗体，标记膜内的抗原（标记膜内的抗体的荧光素的颜色与膜上标记的荧光素的颜色务必不相同）室温20分钟孵育;

9)        用PBS洗一遍弃上清；

10)    用300μlPBS重悬细胞，上机检测

五、流式细胞术中的几点注意事项：

1、对照组的设置：

       在流式细胞术中所测得的量都是相对值，不是**值。如需知道**值时必须设置对照组样品。对照组样品包括有阴性对照和阳性对照。

（1）、阴性对照的设置

²  在实验过程中，如做间接标记法，可设置与一抗无关的实验，即在实验中不加一抗而只加上带有荧光标记的**抗体作为阴性对照管，作为阴性对照。

²  在实验过程中，假设做直接标记法，可设置理论上的阴性细胞作为阴性对照管，实验过程及步骤与实验组务必相同。（做间接标记法时，同样也可同时设置“阴性细胞”的阴性对照管作为阴性对照。